纯化工艺通常分为澄清、捕获和精细纯化阶段——但是随着细胞培养密度的不断提高，导致Protein A柱下游产品洗脱液中HCP和DNA含量的增加，此外，病毒灭活后的浊度上升都成为了精细纯化阶段面临的严峻挑战。针对这些问题，本文介绍一种能够解决Protein A柱纯化效率的整体性方法，即采用新型复合澄清膜用于纯化工艺中的澄清阶段。

全球单抗市场销售额在2017年超过1000亿美元，2011～2017年的复合增长率为11.5%。今后为维持这一快速增长势头，生物制药行业从研发到商业化生产需要新一代的单抗生产工艺。随着细胞培养基及其表达工程体系的不断发展，目标产品表达量已达到15年前的10倍以上，对于一些难度较高的产品其表达量也取得了很大进展，纯化工艺则继续依赖于传统的工艺结构。

目前的单抗纯化工艺结构大部分如图1所示：

图1 传统的单抗纯化工艺

Protein A由于其与抗体Fc片段良好的特异亲和性，较高的纯化倍数，工艺的简易性而被用于大多数抗体纯化工艺中的捕获阶段。然而，在提高细胞培养密度和延长培养周期从而显著提高细胞表达量的同时，Protein A柱的纯化效率也从产品纯度99.9%降至98%～99%。此外，Protein A柱纯化的稳定性下降导致精细纯化工艺更为繁琐。目前，因病毒灭活导致料液浊度提高以及Protein A柱产品洗脱液中HCP和DNA含量的增加，使单抗纯化工艺需要更为复杂的精细纯化步骤和投入更多的成本。

这里我们介绍一种新型的单抗纯化方法，它通过显著加强Protein A柱的效率从而提高单抗纯化工艺的性能表现，基本上能使Protein A产品洗脱液立即达到制药级纯度。

3M EmphazeTM AEX复合澄清膜用于澄清阶段

关于Protein A柱性能变化的影响机制仍旧是非常热门的研究话题，细胞发酵液中高浓度的聚集体被认为是干扰Protein A柱纯化效果的主要物质，并在纯化工艺的各个阶段以导致聚集沉淀的媒介形式存在[1,2]。

为减少细胞发酵液中聚集体的含量，我们在澄清阶段采用3M EmphazeTM AEX复合澄清膜来替换第二级精细深层过滤器。3M EmphazeTM AEX复合澄清膜是一款全合成产品，由高载量的Q-官能团水凝胶介质和0.2 µm 聚酰胺膜组成，能够显著降低细胞发酵液中的可溶性和不溶性杂质。当其用于澄清阶段，可将细胞发酵液中DNA含量降低4 logs以上，通量大于400 L/m2。采用3M EmphazeTM AEX复合澄清膜用于澄清阶段的纯化工艺，及3M EmphazeTM AEX复合澄清膜结构，分别见图2，3。

图2 采用3M EmphazeTM AEX复合澄清膜用于澄清阶段的纯化工艺

图3 3M EmphazeTM AEX复合澄清膜结构

具有层析机制的澄清解决方案

这里我们考察了将Zeta PlusTM粗级深层过滤（去除细胞）和3M EmphazeTM AEX复合澄清膜相结合应用于澄清工艺阶段的性能表现。该产品形式易于放大，适用于从实验室到生产规模的整个工艺发展流程。图4总结了该产品组合的澄清效果。从图中可以看到澄清后的料液浊度持续保持在0.6 FTU。且澄清后料液易通过0.2 µm或0.1 µm过滤器，随后经Protein A柱纯化。由于其独特的结构设计，3M EmphazeTM AEX复合澄清膜处理料液过程中其压差几乎没有变化，出口料液浊度也维持稳定。

图4 AEX复合澄清膜对于DNA及HCP去除情况

AEX复合澄清膜也能够显著降低细胞发酵液中DNA和HCP的含量。

Protein A柱纯化后产品纯度

具有层析机制的澄清工艺显著加强了Protein A柱的捕获效率，并就HCP和DNA含量上来讲，可获得更高纯度的产品。如图5所示，对比了采用3M EmphazeTM AEX复合澄清膜与仅采用传统深层过滤器用于澄清工艺对于Protein A洗脱液单抗纯度的影响。结果非常明显，结合具有层析机制的澄清工艺使Protein A柱洗脱液中产品纯度就HCP和DNA含量来看可接近或达到注射级标准。

我们对该工艺的平台化进行测试，结果表明对4种不同单抗产品的纯化结果非常相似。

图5 四种不同单抗的DNA及HCP去除情况

总结

本文介绍了采用3M EmphazeTM AEX复合澄清膜用于澄清工艺的单抗纯化新方法。当其替换第二级精细深层过滤器时，细胞发酵液中DNA含量降低量>4 logs，并提高Protein A柱的纯化效率，使Protein A洗脱液中产品纯度达到或接近注射级标准。

这种工艺改进的结果从根本上加强了工艺性能的表现，包括：

● 重建并简化下游精细纯化工艺；

● 若产品聚集体含量已足够低的情况下，则可去除精细纯化工艺和最终的病毒清除步骤。

该技术以其高稳定性、可放大性和易于实现的特点，作为澄清工艺平台的应用极大地帮助单抗生产扫清障碍。

【参考文献】

[1] Gagnon.Emerging Challenges to Protein A

[P].BioProcess International, 2013.

[2] Gagnon et.Nonspecific interactions of chromatin with immunoglobulin G and protein A, and their impact on purification performance [P].Al, Journal of Chromatographic A, 2014.

文/叶璇

本文作者就职于3M中国有限公司。