质谱技术临床实验室应用

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关键词:质谱技术 临床实验室应用

    导读

    质谱技术在过去的几十年得到迅猛的发展。与传统的检测方法相比,质谱技术具有高灵敏度、高特异性、高准确度、线性范围宽及高通量等优点,因而有众多临床实验室已经开始或积极准备应用相关质谱技术扩展专业范围和提升检验能力。 


    本文来源:中华检验医学杂志, 2019,42(6) : 395-398.


    一、常用质谱的类型及临床应用


    (一)液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography-mass spectroscopy,LC-MS)


    LC-MS因其具有灵敏度和特异度高、检测时间短、可以实现多重检测、适用范围广的特点,可广泛应用于血液、尿液等样品中的各种代谢产物以及蛋白质、多肽、维生素、激素等分析,已成为临床检验工作中重要的前沿检验技术。


    1.新生儿遗传代谢病筛查:


    遗传代谢病又叫做先天代谢缺陷,会对新生儿产生严重的危害,如果不能及时发现,甚至可能危及生命。LC-MS可以在比较短时间内高通量分析干滤纸血片上的氨基酸图谱和肉碱图谱,大大提高了检测时间和通量。目前已有研究表明LC-MS可以筛查出的遗传代谢病包括高苯丙酮酸血症、高胱氨酸尿症、瓜氨酸血症、甲基丙二酸血症、3-甲基巴豆酰基辅酶A羧化酶缺乏症、极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症等。目前,美国和欧洲大部分的国家和地区已采用LC-MS/MS进行新生儿遗传代谢性疾病筛查,已被业界认为是新筛的"金标准"方法。


    在新生儿遗传代谢病筛查中,传统的免疫学方法由于方法学的限制,小分子物质的干扰等原因,无法得到准确的结果;而且一次仅可检测一种生物样品成分。质谱的一血多检优势明显,而且检测项目越多综合成本越低。这种高灵敏度、高通量、低成本的特点使其成为临床新生儿代谢病筛查常用的技术手段之一。


    2.药物浓度检测:


    当今药代动力学的研究对检测通量和灵敏度都有较高的要求,LC-MS在这方面具有突出优势,已经被广泛应用在血药浓度检测、抗生素浓度检测以及食品中化学农药残留方面的检测中。已经有研究者建立了应用LC-MS定量检测人血浆中甲硝唑、2-羟基甲硝唑、丙戊酸、万古霉素的方法并应用于药代动力学研究。结果表明与免疫检测方法比较LC-MS方法更加灵敏。


    目前血药浓度检测的主要方法有光谱法、免疫法、色谱法、质谱法等。相比于传统方法,质谱法是更为灵敏、精准和经济的检测方法。


    3.维生素类检测:


    机体维生素的水平与生长发育、生理活动的正常进行都有密切关系,有大量应用LC-MS检测血清中维生素D水平的研究报道。目前临床实验室应用LC-MS技术一次可进行多种不同类型维生素检测,从而可大大降低检测成本,具有检测高效、高灵敏度及高特异性的特点,已经作为维生素临床检测的主流技术。近年来,随着生物体内不同类型维生素含量变化与疾病关系研究的不断深入,LC-MS方法应用于维生素检测在临床实验室有快速普及之势。

    4.激素类检测:


    目前临床实验室检测激素的方法普遍使用的是化学发光或电化学发光方法(化学免疫法),但由于激素类物质在生物样品中含量低、免疫学方法存在的嗜异性及自身抗体干扰等问题,常常导致化学免疫方法用于激素检测灵敏度不够、稳定性差,从而大大影响了临床实验室检测激素结果的可信度。随着质谱技术的推广应用,LC-MS在激素检测中发挥了重要作用,其高灵敏度、高稳定性优势非常明显,检测项目快速增加,受到临床内分泌学科的高度认可。


    5.肿瘤标志物筛选:


    LC-MS可以高通量分析检测肿瘤患者与健康人体液中代谢成分的差异,从而筛选出潜在的肿瘤标志物。目前,LC-MS对肿瘤标志物的筛选已经取得了很大进展。Jasbi等应用LC-MS分析了乳腺癌患者血浆中的代谢产物,检测分析了具有潜在生物学相关性的105种代谢物。LC-MS也已经应用在早期非小细胞肺癌、胃癌等多种肿瘤标志物的筛选与鉴定中。充分利用质谱技术的高通量特点,结合大数据技术的综合分析能力,必将大幅提升生物标志物在肿瘤诊治中的灵敏度和特异性。


    (二)气相色谱质谱技术(gas chromatography-mass spectroscopy,GC-MS)


    1.尿液中代谢产物的检测:


    由于尿液中常包含如氨基酸、糖类、有机酸、醇类等代谢终产物,其浓度高于血清,易于收集,而且大部分代谢产物易挥发,所以可通过GC-MS检测尿液的特征性代谢产物,为诊断遗传代谢缺陷病提供可靠的依据。


    目前国内已有实验室建立了常见遗传性代谢缺陷病的特征性代谢产物质谱图谱库,通过检测尿液中特征性代谢产物得到谱图,之后与内标峰面积进行比对,可以开展半定量测定。这种半定量方法虽简便、快捷,但由于缺乏每种被测物质的标准曲线,所以不属于真正的定量,且实验结果易受标本肌酐值影响,重复性和准确性有待进一步优化,测定值难以与其他实验室进行室间比较。随着GC-MS分析技术的发展普及,它已经成为遗传代谢缺陷病早期筛查与诊断的可靠手段。


    2.在毒物筛查中的应用:


    临床上误食有毒有害物质后会导致不同系统的急性、亚急性疾病。快速有效地确定致毒物质是后续临床治疗的关键。在临床毒物分析诊断工作中,由于样品的复杂性、毒物种类的广泛性、分析目标物的不确定性、各种检验方法的局限性,使得毒物筛查技术一直备受毒物分析工作者的重视。随着质谱技术的发展,通过质谱数据库的比对查询来确认未知化合物变得相对简单易行。GC-MS具有与之相匹配的有机质谱数据库,该技术也是到目前为止最为成熟的技术,是未知毒物筛查确证的金标准。GC-MS在毒物筛查中,可以快速、高效、方便地为临床诊断、治疗提供依据。GC-MS不适于难挥发、强极性、易热解的有毒有害物质。LC-MS技术对于难挥发、强极性、热不稳定毒性化合物的分析具有一定的优势,是未来毒物筛查技术的发展方向之一,多种检测手段的联合使用可提高未知毒物筛查确证的效果。


    (三)电感耦合等离子体质谱技术(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)


    人体内许多生物大分子如蛋白质、核酸、激素、酶等在维持正常的生理机能时,需要一些微量金属离子的参与,这些离子的过多摄入或者不足都会不同程度引起生理功能的异常,因此需要检测一些药物、食物、环境中各种元素的含量。但一些药物的成分复杂、微量元素含量低;环境中各种物质元素组成复杂,检测时相互干扰严重;传统检测生物体微量元素的方法如原子吸收法、原子荧光法等操作繁琐、稳定性较差,不能满足临床检测要求。自20世纪80年代问世以来,ICP-MS质谱仪的应用得到迅速的发展。除C、H、O以外,元素周期表中几乎所有的元素都可以使用ICP-MS完成定量分析。而且,其具有对样本类型要求较低,检测灵敏度高、干扰少、超痕量检测限、检测线性范围宽等诸多优点。


    (四)基质辅助激光解吸飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of -flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)


    MALDI-TOF MS可用于对核酸、蛋白质、有机物等的快速分析,包括目前临床应用最为广泛的微生物鉴定、核酸分析等。


    1.微生物鉴定:


    临床微生物实验室对样本中细菌的鉴定主要依赖于传统的检测方法如形态学、生化反应、免疫学等,检测周期长且部分疑难菌种不易鉴定,不能满足临床诊断时效的需要,尤其是应对菌血症、败血症等重症感染的情况。MALDI-TOF MS在这方面有独特的优势。该技术对样品纯度要求不高,可以直接使用临床样本,或者经过分离培养挑选单菌落进行检测,获得其蛋白质谱图,与更新的微生物数据库参考图谱进行比对,从而鉴定至属、种、乃至亚种的水平,缩短了鉴定的时间。对临床常见的隐球菌鉴定,MALDI-TOF MS也表现了极好的鉴定能力。


    MALDI-TOF MS的优势还表现为不仅可以对分离菌进行鉴定,近期已有较多的报道应用其鉴定血培养瓶增菌后的微生物。但MALDI-TOF MS临床微生物鉴定应用中仍然存在一些问题,如数据库不全导致部分不常见菌株的鉴定困难,亚种鉴定局限;样本直接鉴定时,标本内菌量对鉴定结果的影响;不同实验室操作差异,对检测重复性的影响等。


    2.核酸分析:


    相比与传统PCR技术,MALDI-TOF MS在基因SNP检测方面具有一次检查多个位点的优势。基于单碱基延伸基础上的MALD-TOF MS核酸检测技术,能够快速、可靠、高通量开展SNP位点分析。目前MALDI-TOF MS技术已较为广泛的应用于个体识别和亲权鉴定、胎儿RHD基因型鉴定、软骨发育不全基因筛查、耳聋基因热点突变检测等方面。


    二、质谱临床应用面临的挑战


    在中国,临床质谱技术属于新兴的检测方法,临床应用尚在起步阶段,仅有某些大型医院临床实验室和第三方医学检验机构开展了质谱检测,检测项目也比较有限,其应用广度和深度都远不如欧美国家。究其原因,既有行业政策环境的制约,也有实验室能力及质谱技术本身局限性等因素。


    (一)行业政策的制约


    由于质谱技术的高灵敏、高能量等优势,其在临床实验室应用具有广阔的前景。但由于目前检验项目准入、收费定价等方面因素的制约,目前除了微生物鉴定方面的应用外,其他方面的应用无法广泛开展,严重制约质谱技术的发展。


    (二)质谱设备价格昂贵


    目前质谱技术在临床实验应用普及性不足,质谱设备价格昂贵,仪器维护和运行成本高也进一步限制了质谱技术临床实验室的开展。


    (三)技术自身的局限性


    由于我国医院(特别是大型医院)临床实验室普遍具有标本量大、技术人员配备不足的问题,需要高自动化、高稳定性、配套应用试剂的检验设备支撑。而目前质谱设备在临床实验室应用还需要进行样品前处理、人工进样等相对复杂的步骤,无论从自动化、还是稳定性等方面与目前实验室广泛应用的常规检验设备相比都还存在不小的差距。


    (四)实验室条件不足


    质谱技术目前还属于检验前沿技术,其应用过程及结果分析的相对复杂性对实验室技术人员的能力要求远高于现有的常规检验设备。由于质谱分析过程中挥发性有机溶剂等成分可能造成实验室人员的损害,质谱设备运行过程中对温度、湿度要求高。这就要求质谱运行实验室具备排风及温、湿度保障系统。


    (五)方法学标准化需要提升

    为了准确定量生物样品中不同成分,生产厂家研发了不同方法学原理的不同类型质谱。由于质谱方法应用于临床常规检验时间还比较短,特别是国内可以说是刚刚起步,质谱设备常规应用中,实验室需要根据不同品牌、型号、检测样品中物质类型、含量、检测通量等对其方法学参数及条件进行优化。尽管目前有一些企业在开发生产商品化试剂盒提供实验室使用,但在实际应用中仍然存在一定的局限性。


    (六)质量管理有待完善

    由于质谱操作过程中需要样品前处理、人工进样等相对复杂的流程,对操作人员的技术能力要求高,方法标准化水平低等原因,给实验室分析前、中、后全过程质量管理中人、机、料、法、环的控制带来了挑战。由于国内质谱技术临床应用目前还不够普及,很多检测方法为实验室自建,如果再应用于多种成分检测,给室内质量控制的质控品制备、检测系统性能验证、实验室间比对等方面都带来难度,目前质谱检测方法的实验室间质量评价还没有全面展开。

    综合以上临床质谱发展的现状,表明我国质谱技术的临床应用较欧美发达国家还有较大的差距。要加快质谱技术在临床实验室应用,必须努力做好以下方面的工作:一是充分利用相关学术组织,积极围绕质谱技术临床实验室应用需求、存在问题和解决措施等进行研讨,并将研讨结果形成报告提供给相关监管部门作为其政策决策时参考;二是积极组织相关行业学会、质谱仪器制造商、医院检验科、第三方医学独立实验室开展技术宣传、人员培训、标准化方法推广;三是加强质谱实验室构建、技术人员上岗、操作流程的规范化管理;四是联合大学、研究所、设备制造商、实验室技术人员,联合申请相关科研基金或融资开展国产质谱设备、利用质谱技术原理开展专用质谱设备(专门用于某一类型项目检测)、及全自动化质谱设备、质谱仪器流水线的开发,扩大质谱技术临床实验室应用的普及,降低质谱设备临床应用成本。期待在不久的将来,临床质谱技术能更好、更广泛的为医学检验服务,让检验结果更加准确、快速、有效,为推进健康中国服务。


    (审核编辑: 智汇小新)